مقدمه: از زمان شیوع پاندمی حاد تنفسی در سال 2019،  ویروس عامل (SARS-CoV-2) با تکامل و توسعه جهش‌های متنوع، راه های فرار از سیستم ایمنی را به صورتی سریع و مؤثر طی کرده است. ماهیت جهش یافته ویروس نگرانی هایی را در مورد افزایش انتقال و عفونت زایی ویروس ایجاد کرده است که خود الهام بخش تلاش های جهانی جامعه تحقیقاتی برای ردیابی و درک چگونگی پیدایش انواع جهش ها شده است.

هدف طراحی مطالعه پیش رو 1- ارزیابی ظرفیت تکاملی و جهش پذیر SARS-CoV-2، و دستیابی به بینش عمیق تر در موضوع فراوانی و پویایی جهش ها ی ویروس 2- بررسی جهش های ایجادشده در شرایط ازمایشگاهی (In –vitro) و مقایسه ان با انواع درون تنی (In -vivo)  3- بررسی تاثیر جهش های ایجاد شده در شرایط آزمایشگاهی روی کاهش حدت، انتقال و بیماریزایی ویروس برای دستیابی نوع واکسینال زنده و تخفیف حدت یافته

روش کار: از 8 نمونه سواب حلقی که در ازمایش اولیه با روش RT-PCR تحت عنوان سارس کووید -2 مثبت تشخیص داده شدند نمونه ای که دارای سرعت رشد بیشتری در کشت سلول بود جدا سازی شده، هویت و عدم الودگی به سایر ویروس های ناخواسته تایید گردید. سپس در بیش از 30 پاساژ متوالی تلقیح ویروس دردو رده سلولی دیپلوئید ریه جنین انسان (MRC-5) و سلول کلیه میمون وروت (Vero-E) مورد مطالعه قرار گرفت. به موازات تداوم تلقیح ویروس در پاساژ های متوالی کاهش دما از 37 به 30 درجه نیز اعمال گردید. متعاقباً عیار سنجی مقایسه ای با استفاده از دو روش RT-qPCR  وCCID50 انجام شد. در ادامه برای ارزیابی موتاسیون ها، توالی‌یابی ژن اسپایک در فواصل پنج پاساژ با طراحی 4 جفت پرایمر با روش سنگر انجام شد.

نتایج: مقایسه انالیز نتایج بدست امده از حدت و پاتوژنیسیتی در فواصل هر پنج پاساژ برای پاساژهای 5 ،10 ،15 ، 20 ،25، 30 با استفاده از اندازه گیری مقایسه ای کاهش سایز پلاک از پاساژ 15 به بعد در مقایسه با پاساژهای زیر 9مشاهده شده است.اندازه گیری پوتنسی با دو روش (CCID50) و (RT-PCR) تغییرات فاحشی را در ویروس رشد یافته در دمای 37 درجه بین دو سلول بین دو رده سلولی Vero , MRC-5 نشان نداده است. اما عیار ویروس برداشت شده از رده سلولی MRC-5در دمای 30 درجه در مقایسه با رشد ویروس روی همین سلول در دمای 37 درجه یک لوگ کاهش نشان داده است. انالیز توالی یابی ناحیه اسپایک در دمای 37 درجه در تمام پاساژها موتاسیون قابل ملاحظه در مقایسه با ویروس‌های اولیه و وحشی نشان نداده است. اما توالی سکانس در ویروس رشد یافته در دمای 30 درجه نشان دهنده بروز پنج موتاسیون می باشد. در این موتاسیون ها که بواسطه تطبیق ژنتیکی (adaptive genetic) ویروس به رشد دردمای پایین تراز دمای بدن یعنی 30 درجه، دو جهش‌ به صورت تبدیل ویژگی هیدروفوبی پپتید به هیدروفیلی با جانشینی باز در رده سلولی دیپلوئید ریه جنین انسان را شناسایی کرد. این جهش به صورت پایدار در پاساژ های متوالی از 12 الی 23تکرار گردید. افزایش بازه زمانی از 48به 96 ساعت برای ظهور کامل اثرات سیتوپاتیک ویروس روی سلول در دمای 30 درجه می تواند نشان دهنده کاهش حدت ویروس باشد.

بحث: تغییرات ژنتیکی مشاهده‌شده SARS-CoV-2 در شرایط آزمایشگاهی را نمی‌توان صرفاً تحت عنوان جهش‌های تصادفی توضیح داد، بلکه احتمالاً ناشی از انتخاب طبیعی ویروس متعاقب، عادت یافتن به رشد در دمای پایین تر از بدن (30 درجه سانتیگراد) ودر جهت پایداری توانمندی (Potency) و تکامل درخود جمع می‌کند. در این مسیر رقابت، شبه گونه های باقی مانده در مجموعه ژنی جمعیت 2- SARS-CoV برای بقای خود دردمای تحمیل شده در آزمایشگاه، جهت انتخاب را با موتاسیون تقویت کرده و سرعت تغییر تکاملی خود را افزایش می دهد. شرایط تحمیل شده در ازمایشگاه باعث کاهش حدت ویروس، و متعاقبا افزایش بازه زمانی ظهور اثرات پاتولوژیک ان می شود. تغییرات این چنین درخصوص بسیاری از ویروس های واکسینال مانند فلج اطفال و سرخک، سرخجه و اوریون نیز با همین روش و در شرایط ازمایشگاه باعث تولید سویه های واکسینال زنده تخفیف حدت یافته شده است. در تحقیق پیش رو اگرچه نتایج موید این اتفاق در شرایط ازمایشگاه و خارج از بدن (invitro) می باشد. اما الزاما تایید نهایی بدنبال تزریق ویروس در مدل حیوان ازمایشگاهی و با ارزیابی ضایعات پاتولوژیک وعوارض کلینیکال آن، در شرایط درون تنی (In vivo) حاصل خواهد شد.

اشرف محمدی، دکترای تخصصی بیوتکنولوژی، عضو هیئت علمی دانشیار، رئیس واحد تولید واکسن های ویروسی مصرف انسانی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی.وزارت جهاد کشاورزی

جلسه شاخه زیست شناسی گروه علوم پایه

19 خرداد 1401